Už vám někdy odešel pevný disk? Následovalo zděšení přímo úměrné uplynulé době od posledního zálohování a nepřímo úměrné času stráveného správou vašeho počítače? Snad vás při této děsivé vzpomínce uklidní, že vaše pocity jistě byly nesrovnatelné s čirou hrůzou, jež by se vás zmocnila, pokud by váš nosič informací kolem vás beze slůvka rozloučení opravdu fyzicky odkráčel. Chodící datové nosiče? Co v makrosvětě budí dojem uskutečněné noční můry, je na úrovni molekul nesoucích posloupnost kódu zároveň velice zajímavým nástrojem. Z hlediska nanostruktur, nanomanipulátorů, nanofarmacie či nových konstrukcí počítačů jako celku či jejich prvků rozšiřuje možnost pohybu způsoby využití molekul nesoucích informaci. Vedle pokroků v molekulární biologii, odhalujících využití nukleových kyselin samou živou přírodou, lidské poznání přináší stále nové a nové možnosti mnohostranného využití fascinujících molekul – DNA a RNA .
V minulém díle jsme si vysvětlili základní pojmy týkající se nukleových kyselin a ukázali jsme si, jak je možné DNA použít jako konstrukční materiál plošných útvarů či na tvorbu stěn třírozměrných objektů, například nanotruhliček. Nanotruhličky využívají DNA i jako funkční strukturu, která zajišťovala uzamykání a odemykání víčka. Navážeme nyní na tento výklad a v budování světa tvořeného skládáním a různým využitím DNA budeme pokračovat vytvořením dráhy spojující dvě místa a mechanismu, který může přesouvat náklad, opět za použití DNA.
|
Komplementární domény – vzájemně se doplňující části molekul, přesně do sebe zapadající jako klíč do zámku či otisk do formy. Slouží k rozpoznávání na molekulární úrovni. Příkladem mohou být vlákna DNA tvořící dvojšroubovici, úseky t-RNA, zodpovědné za vytvoření charakteristického motivu trojlístku z původní lineární molekuly, aktivní oblasti antigenu a protilátky či signální molekuly a receptoru buněčné membrány. Palindrom – slovo, věta, číslo, melodie, kód, obecně posloupnost symbolů, která dává při čtení zleva doprava i zprava doleva stejný význam. Příkladem může být slovo „nezařazen“ či věta: „Ale jak ta Katka jela.“ Nejpoužívanějším palindromem, nikoli však pro palindrom samotný, bude asi věta: „Je blbej.“ Nejpodlejším palindromem je slůvko „TAHAT“ vyvedené velkými písmeny na průhledných dveřích. V genetice se palindromovou sekvencí rozumí dvě komplementární domény umístěné na jediném řetězci. Na rozdíl od palindromu v původním smyslu je palindromová sekvence nukleotidů v opačném pořadí tvořena komplementárními nukleotidy, například TAAGCATGCTTA. Sekvence nukleotidů – pořadí nukleotidů v nukleové kyselině. Obvykle se zapisuje pomocí jednopísmenných zkratek pro jednotlivé nukleotidy. Vlásenková struktura nukleové kyseliny – struktura vzniklá spojením palindromových sekvencí na jediném vlákně. Lepivý konec DNA – koncový úsek řetězce s nenavázaným komplementárním řetězcem nukleové kyseliny. Základní spojovací prvek při syntéze delších řetězců i složitějších struktur z nukleových kyselin. Významné jsou i při náhradě jednoho řetězce DNA jiným. Oligonukleotid – krátký úsek nukleové kyseliny, tvořený sekvencí zhruba 20 základních stavebních kamenů nukleových kyselin – nukleotidů. Nukleotidy jsou samy tvořeny sacharidovou složkou, zbytkem kyseliny fosforečné a strukturou nesoucí informaci – heterocyklickou dusíkatou bází. Hybridizace nukleových kyselin – spojení komplementárních úseků dvou nukleových kyselin různého původu. |
Krátce připomeňme, že nukleové kyseliny jsou heteropolymery nukleotidů , tedy polymery tvořené různými základními stavebními prvky – monomerními jednotkami. Jednotlivé nukleotidy daného typu nukleové kyseliny se liší dusíkatými bázemi, jejichž elektronová struktura zprostředkovává vlastní rozpoznávání informačního obsahu nukleových kyselin. V ribonukleových kyselinách se vyskytují čtyři báze adenin, guanin, cytosin a uracil; v deoxyribonukleových kyselinách pak adenin, guanin, cytosin a thymin. (Vedle těchto majoritních bází se v nukleových kyselinách nacházejí i báze méně časté, minoritní, které jsou zajímavé z hlediska biologie, dosud však nejsou široce využívány v DNA a RNA nanotechnologiích , takže je v dalším výkladu nebudeme uvažovat.) Vazba mezi nukleotidy je uskutečňována prostřednictvím zbytku kyseliny fosforečné: na uhlík 5’ v sacharidové složce jednoho nukleotidu je přes fosforečnanový můstek navázán uhlík 3’ v sacharidové složce (ribóze či deoxyribóze ) druhého nukleotidu. Řetězce nukleových kyselin jsou orientované struktury, jejich odlišné konce se popisují podle uhlíku v sacharidové složce nukleotidu, který není navázán na sousední nukleotid pomocí zbytku kyseliny fosforečné: 5’ konec a 3’ konec. Jednotlivé řetězce nukleových kyselin se nevětví a jejich uspořádání může být zapsáno pomocí jednopísmenných zkratek odvozených od prvního písmene přítomné báze jako posloupnost tvořená velkými písmeny A, C, G a U pro RNA nebo A, C, G a T pro DNA.
Rozpoznávání bází v nukleových kyselinách je uskutečněno díky párování bází . DNA je v přirozeném stavu tvořena dvěma řetězci, které jsou po celé délce vzájemně komplementární .
Je libo DNA či RNA? Máte ji mít. A jakou sekvenci si budete přát?
Prvním krokem při vytváření světa ze stavebnice z kusů nukleových kyselin je opatření si stavebního materiálu. První možností je využít darů přírody a použít vhodné úseky DNA či RNA vytvářené živými organizmy, ať už se jedná o jejich vlastní genetický materiál, nebo o parazity na úrovni nukleových kyselin – viry , případně u bakterií fágy . Druhá možnost je vytvářet nukleové kyseliny uměle: skládat je vzájemným navázáním definovaných krátkých úseků nukleové kyseliny – oligonukleotidů . (Otázka vytvoření velkého množství kopií existujícího úseku nukleové kyseliny je na příkladu polymerázové řetězové reakce probrána v AB 38/2009).
Ačkoli oligonukleotidy jsou komerčně dostupné, stačí vyplnit formulář s požadovaným pořadím nukleotidů a o zbytek se za patřičný obnos postará firma, zamysleme se nad tím, jak si vytvořit úsek nukleové kyseliny s pořadím nukleotidů dle vlastního přání. Prvním krokem je příprava čtveřice potřebných nukleotidů, přesněji jejich vhodných derivátů. Derivát prvního nukleotidu vytvářeného řetězce se obvykle ukotvuje pomocí chemické vazby k pevnému nosiči. Díky tomuto ukotvení je možné prostým vyplachováním měnit reakční směs a postupně narůstající řetězce oligonukleotidů zůstávají v reakční nádobě. Aby se v každém reakčním cyklu navázal právě jeden nukleotid, musí být zabráněno řetězení stejných nukleotidů v reakční směsi. Dosáhne se toho použitím derivátu patřičného nukleotidu namísto samotného nukleotidu. Vazebné místo, na které se navazují následující nukleotidy, je pomocí navázaného radikálu na úrovni chemické vazby zablokováno. Pro názornější představu si můžeme přestavit, že vazebné místo, ve kterém se prodlužuje řetězec nukleové kyseliny, je překryto jakousi ochrannou čepičkou. Tato čepička se odstraní až v dalším kroku, až po vypláchnutí volných nukleotidů, které nejsou navázány na pevný nosič, z reakční nádoby.
Schéma syntézy oligonukleotidů, krok 1: Navázaní prvních nukleotidů na pevný nosič.
Vazebná místa jsou chráněna čepičkami.
Schéma syntézy oligonukleotidů, krok 2: Uvolnění vazebných míst
Syntéza oligonukleotidů, krok 3: Přidání následujících nukleotidů.
Schéma syntézy oligonukleotidů, krok 4: Prodloužení oligonukleotidu o další
nukleotid. Prodlužování pokračuje opakováním kroků 2 – 3.
Schéma syntézy oligonukleotidu na příkladu trinukleotidu
tvořeného třemi různými nukleotidy.
Palindromy, vlásenky, lepivé konce, příčné můstky
Máme-li k dispozici technologii jak postupně prodlužovat řetězec nukleové kyseliny , je otázka, proč vlastně sestavovat celou molekulu z krátkých úseků. Proč ji vlastně nevystavět rovnou celou nukleotid za nukleotidem?
Pokud vás to jen napadlo, prozrazujete na sebe, že jste pořádní a nikdy byste nenosili týden v jedné tašce sluchátka, nabíječku k telefonu, propojovací USB kabel a drátovou anténu. Vězte tedy, že zmíněné lineární útvary vytvoří pozoruhodně zašmodrchané klubko, jehož rozmotávání za chmurných úvah o neceločíselných dimenzích dovede zabavit na poměrně dlouhou dobu. Jistě vás zaujme, že nejvíce zamotané jsou tenké kabely sluchátek a nabíječky. DNA je o šest řádů tenčí a nachází se ve vodě, jejíž molekuly do ní neustále narážejí…
Skutečná situace je ještě horší. K lepší analogii s nukleovými kyselinami je třeba vedle nepořádnosti ještě přicházet do styku s malými dětmi, které vám bezelstně ocucaným bonbónem na různých místech zapatlají vaše nedbale uložené kabely. Až budete tato slepená místa odmáčet, láskyplně buďte robátkům vděčni za názorné předvedení důsledku párování nukleových kyselin, ať na jediném řetězci, nebo mezi různými řetězci.
Především přítomnost komplementárních domén na řetězci omezuje délku reálně vytvářených oligonukleotidů na zhurba 200 nukleotidů; obvykle se však vytvářejí oligonukleotidy se zhruba dvaceti nukleotidy. S narůstající délkou řetězce totiž narůstá pravděpodobnost vytvoření komplementárních úseků.
Watsonovo-Crickovo párování komplementárních domén však může být žádoucí. Chcete-li manipulovat s lepicí páskou, to nejsnazší, co při tom můžete udělat, je tuto pásku na něco nalepit. Chcete-li zabránit nekontrolovanému párování nukleových kyselin, spárujete je na sebe sama. Pokud je první polovina řetězce komplementární k druhé polovině, například CACGGTGCGCACCGTG vzniká palindrom , který má přirozenou tendenci se navázat sám na sebe. Pokud je mezi oběma komplementárními sekvencemi umístěna krátká vmezeřená sekvence nukleotidů, vzniká po vzájemném navázání struktura vlásenky, kdy nespárované vmezeřené nukleotidy vytvoří smyčku.
Dalším důležitým motivem z hlediska manipulace s nukleovými kyselinami je lepivý konec . Je tvořen přesahem jednoho ze dvou vzájemně komplementárních řetězců dvouvláknové nukleové kyseliny. Nukleotidy, tvořící přesah na konci DNA, výsledně zůstávají nespárované. Lepivý konec může být využit ke spojování kratších úseků dvouřetězcové DNA, vlastně jakémusi „nastavování DNA“. Zajímavější možností je využití lepivého konce k náhradě jednoho komplementárního řetězce jiným komplementárním řetězcem, který se začne navazovat v místě lepivého konce. Takto byl odemykán DNA zámek nanotruhličky v AB 38/2009. Lepivý konec může být využit k rozpojení vlásenkové struktury , ale také umožňuje přejít z přirozeně lineární struktury DNA, která je vlastní biologii, do dvojrozměrných struktur, které jsou zajímavé pro technické aplikace.
Vlásenková struktura DNA (A) a lepivý konec DNA (B) s vyznačenými nukleotidy
a pomocí schematického naznačení řetězců DNA. Zdroj: Comm. of the ACM 50/9.
Jinou možností, jak se neomezovat pouze na lineární dvoušrobovici, jsou příčné můstky. Představte si dvě identické dvoušroubovice DNA , které na shodném úseku částečně rozpojíte, takže z obou dvoušroubovic ční jednovláknové DNA. Ke každému vláknu jsou komplementární dvě vlákna – jedno z původní dvoušroubovice, druhé ze sousední dvoušroubovice. Vytvořením nové dvoušroubovice s použitím sousedního vlákna vzniká příčný můstek mezi dvěma vlákny. Díky těmto můstkům je možné vytváření DNA origami, popsaných v AB 38/2009.
Příčný můstek mezi dvěma antiparalelními vlákny DNA.
Zdroj: Comm. of the ACM 50/9.
DNA nanorobot
DNA nanorobot je tvořen jednovláknovou DNA , která uprostřed obsahuje napojení 5’ konce na 5’ konec a směrem od středu na obě strany jsou vlákna zakončena 3' konci a plní funkci nohou robota. Tyto dvě nohy se označují jako lichá L-O a sudá L-E. Robot kráčí po lineární trase z čtyřřetězcové DNA s příčnými můstky, ze které ční vlásenkové struktury, upevněné do trasy hybridizací v oblasti smyčky. Tyto vlásenky plní roli nášlapů pro DNA robota. V roztoku jsou dva druhy paliva, vlásenkové DNA , označované jako F1 a F2, které se hybridizují s sousedními nášlapy a tím uvolňují nohy robota. Sudé nohy nanorobota hybridizují pouze se sudými nášlapy, lichá noha pouze s lichými.
Fáze 1: Lichá noha DNA robota je navázána k nášlapnému řetězci T1, sudá noha k řetězci T2. Sudá noha L-E je ve vedoucím postavení, levý řetězec T2 je připraven k navázání molekuly paliva F1. Komplementární domény na palivu F1 a řetězci T2 jsou naznačeny písmenem c. Zdroj: Science 324/5923, pp. 67-71.
Fáze 2: Vlásenková molekula paliva F1 se spojuje s řetězcem T2. Zdroj: Science 324/5923, pp. 67-71.
Fáze 3: Vlásenka paliva F1 je rozpojena a připravena uvolnit lichou nohu navázáním na T1. K hybridizaci s T3 nedochází, komplementární doména je příliš vzdálena. Zdroj: Science 324/5923, pp. 67-71.
Fáze 4: Molekula paliva F1 na nášlapném řetězci T1 vytěsňuje lichou nohu L-O. Zdroj: Science 324/5923, pp. 67-71.
Fáze 5: Palivo F1 nahradilo lichou nohu L-O na nášlapu T1. Zpětné hybridizaci nohy zabraňuje fialově naznačený přesah komplementárních úseků paliva a nášlapu oproti komplementárním úsekům nohy a nášlapu. Zdroj: Science 324/5923, pp. 67-71.
Fáze 6: Lichá noha L-O se díky Brownovým pohybům přemisťuje k nášlapu T3. Přesah komplementárních úseků zajišťující jednosměrnost pohybu je znázorněn zeleně a označen písmenem d. Zdroj: Science 324/5923, pp. 67-71.
Fáze 7: Lichá noha L-Ose hybridizuje s nášlapem T3. Zdroj: Science 324/5923, pp. 67-71.
Fáze 8: Tato fáze je analogická fázi 1, palivo F1 je nahrazeno palivem F2, liché struktury sudými a naopak. Fáze 1-7 se tak opakují pro přesun sudé končetiny. Zdroj: Science 324/5923, pp. 67-71.
Závěr
Výše uvedený způsob není jedinou možností, jak pomocí DNA nanorobota uskutečnit pohyb podél trasy ze syntetické DNA. Dokonce není nutné se omezovat ani na lineární pohyb, principiálně je možné vodicí strukturu vytvořit ve dvou i třech dimenzích. Namísto spotřebování paliva v podobě DNA vlásenek je možné zvolit jiný přístup – do roztoku mohou být cyklicky přidávány vhodné enzymy , které vyhledají přesnou sekvenci nukleotidů , a na tomto místě rozstřihnou řetězec DNA, poté jsou nahrazeny jinými enzymy, které spojí řetězec na jiném místě, následují enzymy, které opět rozstřihnou DNA, tentokrát v místě jiné sekvence, ty jsou pak v posledním kroku cyklu nahrazeny enzymy spojujícími DNA. Ani pohyb kráčením cestující molekuly není nutný – vlásenky ukotvené do vodicí struktury se mohou ohýbat a předávat si molekulu stejným způsobem, jako se přemisťuje vědro vody živým řetězem při požáru. Popsaný pohyb pomocí dvou druhů paliva stále přítomných v reakční směsi však představuje větší potenciál, než jen přesun nějakého nákladu. Pohyb totiž nemusí být vázaný jen na podněty z makrosvěta. Dalším důležitým momentem je skutečnost, že po trase se přejde právě jednou, pak je již vyřazena (ne nutně trvale!) navázáním paliva, jinými slovy robot mění stav z „nepřešel“ do „přešel“. Zároveň je jasné, že DNA je kvalitním nosičem informace (přinejmenším přírodě se osvědčila). Možnost využití jako paralelního počítače, nebo alespoň řídící logiky či paměťového zařízení se tak přímo nabízí.
Vývoj v oblasti pohybu úseků DNA po DNA vodicích strukturách bude jistě nadále pokračovat. Je to bezpochyby správný směr. Abychom se vrátili zpět na začátek: když Vám nyní odejde pevný disk, vzniká odpad, který je nutné složitým způsobem likvidovat. DNA by se neměla jíst moc často, jinak vám hrozí dna (chcete-li podágra či pakostnice), ale strávit se dá. A nepochybuji, že vám takto pojatý recyklační úkon spraví náladu.
1. Wikipedia: Syntéza oligonukleotidů
5. Tosan Omabegho, Ruojie Sha, Nadrian C. Seeman: A Bipedal DNA Brownian Motor with Coordinated Legs; Science 324/5923, pp. 67–71
6. Vítězslav Kříha: Nanotruhličky z DNA; AB 38/2009
7. Vítězslav Kříha: Nanoburlaci – kráčející molekuly I: Inspirace v buňce; AB 7/2010
